免疫细胞化学(coverslip)

免疫细胞化学（Coverslip）

1. 处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；

（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。）

2. 固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；

（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。）

3. 打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；

（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。）

以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：

4. 封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中

夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；

（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。）

5. 孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)

上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。

（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。）

6. 用TBST洗2次， 10min/次；

7. 孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光

孵育1h。

（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。）

8. 用TBST洗2次，5min/次。

（如抗体的非特异多也可多洗。）

9. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。

10. 封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载

玻片上。

（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。）

11.拍照：注意要等Mounting Medium凝固后再拍照。

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