MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

将SDS结晶全部溶解后再使用。

五、MTT法实验步骤

1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×10/ml。

细胞详细计数方法请参照doc.docsou.com中的相关文章。

对于初学者而言，要使细胞达到5-10×10/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一

个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm为例，

1) 细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集

后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2) 另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml

培养基.

3) 从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10

×10/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够

该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

4) 细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细

胞悬液密度为2×10/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×

10/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细

胞密度可略小。

2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔

（边缘孔用无菌PBS填充）。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就

混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,

加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一

天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以

反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为

应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）

再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果444244

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