土壤微生物总DNA的提取和纯化

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土壤微生物总!"#的提取和纯化"

张瑞福/曹慧/，崔中利/""李顺鹏/樊奔/

（/南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室

（#中国科学院南京土壤研究所

南京#/$$$C）

南京#/$$2.）

摘要：本文建立了从土壤中提取总D-)的方法，并通过改进使适合于对革兰氏阳性菌的提

取。用2种性质不同的土壤进行验证，均提取到了D-)，每克干土的D-)提取量从"@"$;E!通过透析袋回收进行纯化，纯化回收率达到?.@"!F，纯化后的土壤D-)可以直接扩/"@!/;，!

增出/?G+D-)。2种土壤的提取率从?$@./FE2"@!.F，可以从每;干土添加"?#个菌体的土壤中扩增到目的条带。

关键词：土壤D-)提取，纯化，提取量，提取率，HIJ扩增中图分类号：G/.!@!

文献标识码：)

文章编号：/$$?0?/32（#$$"）$#0$#3?0$3

［/，#］从自然环境中提取细菌D-)是非常有用的方法，可用于检测不可培养的细菌，跟［"，!］

踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行为。也可以用来揭示土壤微生物生态［.］系统中的基因的多样性及其随环境的变化。从环境样品中抽提和纯化D-)是最关键

［?］

的技术问题之一。来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类

物质在提取过程中不能去除掉，直接影响后续的HIJ扩增、杂交、内切酶消化等。本文建

可应用于环境中微生物的研究。立了适合从不同土壤提取总D-)并进行纯化的方法，

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材料和方法

土壤样品的采集与性质测定

从各地采集了不同性质的土壤，基本性质如表/。菌株

大肠杆菌!"#$%&DK.，霉状芽孢杆菌（’(#&%%)*+,#$&-.*），枯草芽孢杆菌（’(#&%%)**)/0"

，苏云金芽孢杆菌（’(#&%%)*12)3&45&.4*&*）都是本实验室保存；邻单胞菌（6%.*&$+$4(*1&%&*）

（带有甲基对硫磷水解酶基因+7-）。L*(）M?为本实验室分离的甲基对硫磷农药降解菌

［(］

$%’土壤!"#的提取方法

称取.;土壤样品，与/"@.6ND-)提取液（/$$66&’ONP+,L0$%’%$自然土壤D-)的提取：

混合，再加入KI’，/$$66&’ON5DP)，/$$66&’ON磷酸钠，/@.6&’ON-7I’，/FIP)Q，*KC@$）

（/$6;O6N），于##.+O6,:摇床上"3R摇动"$6,:，接着加入/@.6N#$F/$$N蛋白酶1!每隔/.E#$6,:轻轻颠倒几下，室温?$$$S;离心/$6,:，收集上清，转GDG，?.R水浴#9，

"中国科学院南京土壤研究所物质循环开放实验室开放课题（#$#./$#）和红壤站开放课题（#$$/010$/）资助项目""通讯作者

作者简介：张瑞福（/23!4），男，山东人，在读博士生，主要从事环境与土壤微生物研究。5067,’：897:;+<,=<>#?"@:AB收稿日期：修回日期：#$$#0$?0#3，#$$#0$20#2万方数据

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