MTT实验跟踪总结

MTT实验

MTT细胞培养：细胞传代与冻存…（此处略，苹果你已会！）

MTT实验第二阶段（自己总结）

细胞种板：往96孔板中接种适宜数量的细胞，并保证细胞在96孔板小孔中均匀分布，正常生长，是MTT实验成功的首要条件。

主要步骤：

（1）.细胞生长：保证细胞处于对数生长期，简而言之就是将已基本铺满培养瓶底的细胞进行消化，但不传代，就是将旧的培养基换掉，让贴壁的细胞悬浮，并培养一天。此时细胞处于对数生长期，细胞活力最好，有利于MTT实验的结果。

（2）.细胞消化：将昨天的细胞吸去旧的培养基（将死细胞吸走，可用过滤灭菌的PBS溶液轻轻冲洗细胞），加入胰酶消化，随后加入适宜培养基（不宜过多，勿将细胞稀释的过稀，达不到种板所需的细胞浓度要求）。切记利用吹打管将细胞吹打均匀（大量细胞会聚集在一起，细胞分散不均，吹打不匀会影响细胞计数的准确性及随后种板的均一性）；但吹打过猛过多也会影响细胞活力。

（3）.细胞计数：计数之前，应用75%酒精将计数器其载玻片擦拭干净，以免上面残留杂质影响细胞计数。取一小滴（估计20ul左右）吹打均匀的细胞培养液沿细胞计数器上端凹槽轻轻缓慢打出滴下，此时小液滴会自动（虹吸原理）铺满细胞计算器的上部小方块（如图1）；将细胞计算器放置于显微镜下观察计数，找到左上、左下、右上、右下各4块16格的区域（如图2），数下各块区域的细胞数目，并记录数据（计数原则：当有细胞压16格外线时，记上不记下，记左不记右）。得到细胞浓度。

计算公式为：细胞浓度=[（A1+A2+A3+A4）/4]*104/ml

（4）.细胞稀释：就是将细胞稀释到接种于96孔板时细胞接种数目浓度。每孔加入200ul，细胞数目（5000左右，个人认为）。在稀释细胞是既要考虑接种浓度，也要考虑接种总共所需的细胞培养液体积（避免细胞浓度适宜，但体积不够接种于所需加样的小孔）

（5）.细胞加样：每次加样前需要将细胞培养液振荡，加几孔最好吹打一下细胞培养液（防止有的细胞沉降），目的是将细胞混合均匀，保证种板的均一性。根据自己设计的96孔板加样方式，一般一种药物的浓度可配6个浓度，每个浓度加5个重复孔，另外需设有对照组，空白组（一般情况下96孔板外围的36孔不种细胞，加入相同体积的PBS溶液，从而减少内部的60孔中细胞培养液的挥发，称之为边缘效应）（如图3）。

（6）.96孔板观察：当将细胞顺利接种到对应小孔中后，将96

孔板放置于显微镜下观察

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