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Q-PCR操作简易流程--根据试剂盒整理

一、 总RNA提取流程

适量超低温冻结的动物组织,研钵内加液氮研磨,至粉末状

加入适量(100mg组织加1ml)RNAiso Plus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖

室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状

将匀浆液转移至离心管,室温静置5min,12000g 4℃离心5min

小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)

加入氯仿(为RNAiso Plus 的1/5 体积量),盖紧离心管盖,用手剧烈震荡15s

室温静置5min,12000g 4℃离心15min

匀浆液分为3层,吸取无色上清液至新离心管中

上清液中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀,在15-30℃下静置10min

12000g 4℃离心10min,离心后,底部会出现沉淀,即为RNA

小心弃去上清,沿管壁加入1ml 75%乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁

12000g 4℃离心15min,小心弃去乙醇,超净台内干燥2-5min

加入适量(一般40-50ul试沉淀大小)DEPC处理水中,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀

待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存

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