RNA提取及组织匀浆

1、 取组织块（0.2g~1g）最少可到2～5mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤

纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内

2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8％的氯化钠溶液）或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。

3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。

手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。

4、将制备好的10％匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10～15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。

根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50～100mg组织、5×10细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>1067细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，R

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