Western Blot 的心得体会 Microsoft Word 文档

做了五个月的，有一点点小心得，给新手点经验．

蛋白提取：

１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：

组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.

Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)

7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行

（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.

（2）离心机 1000rpm，4℃ 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)

（3）100000g，4℃ 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜后，分装至 EP管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4℃ 离心 30min。

（4）收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。

考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：

考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。

BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。

配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)：

1 2 3 4 53 6

G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml

0.5mg/ml

BSA ------ 20ul 40ul 60ul 80ul 100ul

ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul -----

待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。）

紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线, 标准方程及R值（R值应大于0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。（若加入2ul样品，则浓度值需除2，方为真正浓度；若加4ul样品，则除4）

聚丙烯酰胺电泳：

1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。

2．配胶：

凝胶储备液（30% Acr/Bise）：

丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉）

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