三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析

山东医药2008年第48卷第17期

三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析

于腾波,程永帅

,寇德伟,褚言琛,王爱民

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(1青岛大学医学院附属医院,山东青岛266003;2第三军医大学附属大坪医院)

[摘要] 目的 寻找简捷、高效的原代小胶质细胞纯化培养方法。方法 以小胶质细胞原代培养的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度、减少细胞离心过滤、进行营养丧失培养等改进,培养后期分别采用经典机械分离法、低浓度胰酶消化法和利多卡因分离纯化法行细胞分离与纯化,记录形态变化并采用同倍数视野动态计数,借助CD68及OX42抗体间接免疫荧光标记进行鉴定、计算纯度。结果 三种分离方法均获得了较高纯度和产量的小胶质细胞,其中利多卡因分离纯化法获得细胞数及纯度明显高于其他分离方法,低浓度胰酶消化法次之。结论 小胶质原代细胞培养过程中,利多卡因分离纯化法及低浓度胰酶消化法均可有效提高培养产量及纯度,以利多卡因分离纯化法最佳。

[关键词] 小胶质细胞;原代培养;纯化;鉴定

[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2008)17-0004-03

Correlationandanalysisofmicrogliaprmiaryculturemethods

YUTeng-bo,CHENGYong-shuai,KOUDe-wei,CHUYan-chen,WANGAi-min

(1TheAffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,P.R.China)

Abstract:Objective Tofindaneasyandeffectivemethodforprimarycultureandpurificationofmicrogliacells.Methods BasedonclassicalmicrogliaprimaryculturemethodofMcCarthy,improvementlikeelevationofprimaryinocu-lationdensity,decreaceofcentrifugalfiltrationfrequencyandnutritiondeprivationwereapplied.

Inthelaterpurification

phaseofcellculture,threesub-groupssuchasmechanicalseparationgroup,low-concentrationenzymedigestiongroupandlidocaineseparationgroup,wereparallyoperatedandcultured.Morphologicchangesandcellcountunderthesamemagn-ifiedfieldofscopewererecorded.MicrogliacellswereidentifiedandappraisedbyimmunofluorescencemediatedbyCD68andOX42antibodies.Results Highpuritificationqualityandquantityofmirogliacellswereacquiredinalltheregroups,whilethebestwaslidocaineseparationgroup,followedbylow-concentrationenzymedigestiongroupandmechanicalsepara-tiongroup.Conclusions Duringtheprimarycultureofmicrogliacells,lidocaineseparationandlow-concentrationenzymedigestioncaneffectivelyraisetheproductivityandpuritificationquality,especiallytheformer.

Keywords:microglia;primaryculture;purification;identification

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小胶质细胞是中枢神经系统内重要的免疫感受和效应细胞,具有抗原递呈、病原体吞噬、免疫效应、分泌多种细胞因子和神经修复作用。建立一种高效原代小胶质细胞体外分离纯化培养方法,对深入研究其功能及特性十分重要。早期小胶质细胞培养方法由McCarthy与Gulian等建立,但其操作步骤繁琐,获得细胞数量有限,且含有大量异质性细胞群体。2007年2月~2008年2月,本研究对小胶质细胞原代培养尤其是分离纯化步骤进行对比并改良,现综合分析其技术要点。1 材料与方法

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1.1 材料 级Wistar大鼠乳鼠(青岛市药检所),ibco公司)、0125%胰蛋白酶(Sigma公司),倒置相差显微镜、荧光显微镜(O-lympus),流式细胞仪(EPICS2ALTR型,BeckmanCoulter公司),图像分析仪(VIDSA21),兔抗大鼠CD68多克隆抗体(北京博奥森公司),Cy3标记羊抗兔抗体(Sigma公司),小鼠抗大鼠CD11b/c单克隆抗体(克隆号OX42,BDPharmingen公司),FITC标记羊抗小鼠抗体(北京中杉公司)。1.2 方法

1.2.1 混合培养与形态观察 将出生24h之内的SPF级Wistar大鼠乳鼠置于冰上低温麻醉5min,015%碘伏浸泡5min,75%乙醇中消毒5min。无菌

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