不同分离纯化法原代培养小胶质细胞的生物学差异

目的：比较两种分离方法原代培养所获小胶质细胞的的生物学差异。方法：分别采用振摇法和温和消化法从胶质细胞／神经元的混合培养体系中分离纯化小胶质细胞,通过1,1’-己二酸双酯-3,3,3’,3’-四甲基吲哚菁标记的低密度脂蛋白活体标记显示小胶质细胞的形态学变化,分别用Griess反应和酶联免疫吸附法测定培养小胶质细胞经脂多糖刺激后释放的一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(

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IS 10 S N 0 7—83 7 8细胞与分子免疫学杂志 ( hnJC lMo I uo)09 2 ( C i el lmm n12 0, 5 4

论著

文章编号： 0 7— 7 8 20 )4— 3 6— 3 10 8 3 (09 0 0 6 0

不同分离纯化法原代培养小胶质细胞的生物学差异 李锐，民侠郭，李晓青，种莉’,刘红艳，乐卫东 (陕西省人民医院老年神经科，陕西西安 70 6; 108中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所，上海 20 2 ) 00 5[要]目的：比较两种分离方法原代培养所获小胶质细胞摘的的生物学差异。方法：分别采用振摇法和温和消化法从胶

1材料和方法 1 1材料 . 1—2日龄的 Srq eD we新生大鼠由中科院 pau -a l y 上海实验动物中心提供。 1’己二酸双酯 -,,,一，1一 3 3 3’ 3’四

质细胞/神经元的混合培养体系中分离纯化小胶质细胞，通过 1 1’己二酸双酯一，,,一，一 3 3 3’ 3’四甲基吲哚菁标记的低密度脂蛋白活体标记显示小胶质细胞的形态学变化，分别用 Gis反应和酶联免疫吸附法测定培养小胶质细胞经脂多糖 r s e

甲基吲哚菁标记的低密度脂蛋白(,’d eaey-,,, 1 1 i t el 3 3’ o d 3 3’ tta ty— d c r o y n n— b l d lw e st i o r ti 一er meh li o ab c a i e l ee o d n i l p oen, n a y p

DI cL L购自美国 Sogt i A—D )— t ho司。D ae、 u n公 N s胰酶、 I脂多糖 (i叩o schr e P )自美国 Sg a公司、7 m 1 p l ac ai,L S购 y d i m 5e培养瓶购自丹麦 N nl u c n公司， o胎牛血清 ( B ) ME F S、D M购自美国

刺激后释放的一氧化氮 ( O) N和肿瘤坏死因子 ( N—的浓 T F )度。结果：温和消化法小胶质细胞的得率是振摇法的 5 7倍， . 且其获得小胶质细胞的纯度 ( 9 9± . ) 9 . 0 1%远高于后者。温和消化法所获的小胶质细胞转化为静息状态需要的时间较振摇法明显缩短；经脂多糖刺激后，摇法所得的小胶质细胞振释放 N O和 T FO的水平均较温和消化法者高。结论：和 N .

r .温消化法在小胶质细胞的得率、纯度以及与静息状态的相似性方面明显优于振摇法，因此应在与小胶质细胞有关的实验室研究工作中得到推广。 [关键词]小胶质细胞；细胞培养；多糖；肿瘤坏死因子脂 0; I一氧化氮

Iv r e nio n公司。Gi s tg r s反应试剂盒购自碧云天生物技术研究 e 所。肿瘤坏死因子 (u o ers atr tm rncoi fc一 s o,T F旺)剂盒 N-试 ( p I E IA Kt) Ot A E LS i为美国 B s D公司产品。I aePoPu m g.r ls 4 5图像处理软件为 Mei C b rec公司产品。 . d y e ts a ni 1 2方法 .

12 1神经元一 ..胶质细胞的培养

按以往的方法进行 J。简

言之，分离 1—2日龄的 Srq eD we新生大鼠大脑，细 pau—a l y仔去除脑膜和血管后，吸管吹打 1用 0~1 5次，经含 0 1m/ 再 . LL D aeI 02/ N s的 .5gL的胰酶消化 1 i, 5m n终止消化后将所获的上层细胞按每瓶 2×1个细胞种植于 7 m 0 5c培养瓶中，培养液为含 10mL LF S的 D M, 5 L LC 2 0 / B ME在 0m/ O的培养箱

[中图分类号] R 9 . 2 R 4 . 32 1; 725

[文献标识码] B

小胶质细胞是中枢神经系统中最具免疫学活性 3%中培养， 3— 换液 1,当细胞 10 7每 4d次 0%汇合后，进行的细胞类型，在脑的发育、功能分化等生理过程和许下面的分离纯化步骤。 多中枢神经系统疾病中扮演重要的角色 _。众多研 12 2振摇法、温和消化法分离纯化小胶质细胞振摇法： l J ..

究表明，小胶质细胞介导的慢性炎症反应是帕金森将铺满胶质细胞/神经元的培养瓶置 3℃水平恒温摇床振摇， 7

病、阿尔茨海默病等神经变性疾病发病的有机组成部分。因此，究小胶质细胞的生物学特点，于 J研对阐明上述神经变性疾病的发病机制，寻找有效阻断小胶质细胞活化的药物具有重要意义。经典的小胶质细胞分离培养是基于机械分离的方法，称为“被振摇法”。后来，Sua等创立了一种基于酶消化 ar法的分离纯化技术，效解决了

前者的得率低、化有纯率低的问题。然而，近年的文献中，用此种方法在使的人仍然不多，主要原因可能在于这一新的方法所获小胶质细胞的生物学特性尚未被深入了解。我们通过对两种不同方法所获小胶质细胞的生物学特性进行对比分析，以促进这一新的小胶质细胞分离纯化的方法的推广。 收稿日期： 08— 2 2;接受日期： 0 9 0— 4 20 1— 6 20— 2 2 基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(0 5C 4 ) 2 0一 23作者简介：李锐 (9 2一) 17,男，甘肃天祝人，副主任医师，博士 C re p n i g a t o ors o dn uh r

10rm n 5h后将悬浮细胞收集， 8 i, ,/接种于 2 4孔培养板， 1h后轻轻振摇， 0rrn弃去培养液，壁细胞即为纯化的小 6/ i, a贴胶质细胞。温和消化法：按文献的方法改良，先用不含 ca“ 、

Mg“的 P S洗涤胶质细胞/ B神经元 3遍，然后 0 8gL ./

胰酶一D A 3℃消化， E T 7直到上层细胞开始出现大片收缩脱落 时终止消化， P S冲洗 3遍后收集贴壁的细胞，即为纯化 用 B的小胶质细胞。 12 3得率和纯度 ..小胶质细胞的纯度采用 D l cL L荧 i A .D .

光标记技术进行测定。DI cL L可特异性地被小胶质细胞 iA—D—

摄取后被胞内溶酶体降解，DL不能被进一步降解而被荧光 i 显微镜观察到。上述两种方法所获的小胶质细胞以5m/ gL浓度的 DI cL L在 3 q孵育 4h然后用 D M清洗 3次， i A—D— 7G, ME 直接在荧光倒置显微镜下观察。小胶质细胞的纯度用 1 0个随机视野 (×10中荧光标记的阳性细胞数除以同一视野下 0) 光镜中的细胞数。

12 4小胶质细胞形态学的观察 ..

胞体出现细长的分支是

小胶质细胞机制状态的重要标志，因此通过观察出现分支的状况可反映小胶质细胞趋于静止状态的程度。利用相差显微镜随机选取 2个视野(x 0 )拍照后利用 I aePoPu . 0 0, 2 m g.r ls 5 4

Te:1 0 6 2 0 9:E— i:l l 3 9 9 32 mal mmi y a . e l eh nt@

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