小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37ºC Humidified tissue culture incubator (37ºC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech)

2.实验步骤

2.1星形胶质细胞的混合培养

取新生SD小鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2星形胶质细胞的分离和纯化

将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/L PBS 洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶，37℃ 消化15 min 左右，至镜下观察到大部分星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培养基中止消化，1000 r/ min离心5 min，再用PBS 洗2 遍后，重悬于含10% FBS DMEM/F12 培养基中，种于培养瓶中; 将培养瓶置于37℃细胞培养箱稳定贴壁1 d 后，再用37℃恒温定轨摇床，200 r/min 振摇2 h;吸取上清液弃去(其中主要包括一些小胶质细胞和部分少突胶质细胞) ，贴壁细胞采用0. 25% 胰

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